15.30. Xác định hiệu lực vắc xin dại theo phương pháp Habel

 

Nguyên lý

Gây miễn dịch cho chuột nhắt trắng với một độ pha loãng vắc xin. Sau 14 ngày thử thách bằng chủng thử thách CVS  với nhiều độ pha loãng khác nhau.

 

Nguyên vật liệu

Chuột nhắt trắng 4-6 tuần tuổi, trọng lượng 13-16 g.

Vắc xin dại thử nghiệm.

Chủng CVS.

Huyết thanh ngựa thường.

Nước vô khuẩn để tiêm.

Nước muối sinh lý

 

Phương pháp tiến hành

Pha vắc xin và gây miễn dịch

Từ 1 ống nghiệm có ít nhất 3 ml hỗn dịch vắc xin dại lấy ra 1 ml trộn với 39 ml nước muối sinh lý (đã được làm lạnh), lắc đều và để ngay trong điều kiện lạnh.

Tiêm miễn dịch cho 60 chuột, mỗi chuột 0,25 ml vào phúc mạc. Tiêm 6 mũi, mỗi mũi cách nhau 1 ngày. Song song nuôi 1 lô chuột đối chứng gồm 40 con. Đến ngày thứ 14 kể từ khi tiêm miễn dịch mũi đầu tiên thì tiến hành tiêm thử thách.

Pha chủng CVS và thử thách

Hỗn dịch 20% chủng CVS bảo quản ở nhiệt độ -70^OC được làm tan nhanh dưới vòi nước chảy.

Pha loãng từ 10^-1 đến 10^-7 bằng dung dịch huyết thanh ngựa 2% (98 ml nước cất 2 lần vô khuẩn + 2 ml huyết thanh ngựa thường đã bất hoạt 56^OC trong 30 phút).

Tiêm vào não chuột mỗi con 0,03 ml.

Đối với lô chuột miễn dịch, tiêm  các độ pha: 10^-5, 10^-4, 10^-3, 10^-2, 10^-1

Đối với lô chuột đối chứng, tiêm các độ pha: 10^-7, 10^-6, 10^-5

Theo dõi và tính kết quả

Sau khi tiêm thử thách, hàng ngày theo dõi 2 lô chuột và ghi kết quả đầy đủ.

Những chuột chết trước ngày thứ 5 sau ngày thử thách không được tính trong kết quả.

Những chuột chết, liệt do dại sau ngày thứ 5 được coi như chết vì bệnh dại.

Đọc kết quả cuối cùng vào ngày thứ 14 sau khi tiêm thử thách. Kết quả được tính theo phương pháp Reed-Muench.

LD₅₀ bảo vệ = LD₅₀ của chuột đối chứng - LD₅₀ của chuột miễn dịch.

Trong đó LD₅₀ của chuột đói chứng và chuột miễn dịch được tính theo công thức :

                              50 - a

log LD₅₀ = log A - -------- x k

                              b - a

A : Độ pha loãng của CVS gây chết chuột ngay sát dưới 50%.

a: % chuột chết ngay sát dưới 50%.

b : %  chuột chết ngay sát trên 50%.

k : log bậc pha loãng.

 

Ví dụ tính kết quả theo phương pháp Reed- Muench:

1. Lô đối chứng

Độ pha CVS    Chuột chứng    Tổng số tích luỹ                            Số %chuột chết

                        Sống    Chết     Sống   Chết    

10^-5                  0          10           0       17                           17/17=100

10^-6                  4          6             4         7                              7/11=64

10^-7                  9          1            13        1                                1/14 = 7

 

                50% - 7%           43

LD50  =    --------------  =   -----  = 0,75

                64% - 7%           57

 

LD₅₀  đối chứng = 7- 0,75  = 6,25

Từ đó: Log (50% của độ pha loãng cuối cùng) = -6,25

và 50% của độ pha loãng cuối cùng (hiệu giá LD₅₀) = 10 ^-6.25.

 

2. Lô chuột miễn dịch.

Độ pha CVS    Chuột miễn dịch         Tổng số tích luỹ                     Số % chuột chết

                        Sống    Chết                Sống      Chết   

^‑10 ^-1                 4          6                      4         20                    20/24=83,83

10 ^-2                 5          5                      9          14                    14/23=61

10 ^-3                 3          7                      12        9                      9/21=43

10 ^-4                 8          2                      20        2                      2/22=9

10 ^-5                 10        0                      30        0                      0

 

                     50% - 43%            7

LD₅₀   =      ---------------  =     -----   =  0,39

                     61% -43%           18

Từ đó: Log (50% của độ pha loãng cuối cùng) = -2,61.

và 50% của độ pha loãng cuối cùng = 10^-2,61.

Vậy:

LD₅₀  bảo vệ = 6,25 - 2,61= 3,64.

Vắc xin bảo vệ được: 10^-3,64 LD₅₀ .

Tính ra bằng: 4 364 LD₅₀ ;

Lấy tròn: 4 400 LD₅₀ bảo vệ.

Kết luận: Theo tiêu chuẩn LD₅₀  bảo vệ tối thiểu phải bằng 1000, vậy vắc xin đạt yêu cầu về hiệu lực.